2018年8月21日，随亚伯拉罕.林肯号出海测试的一架VFA-125中队的F-35C在弗吉尼亚卡佩斯海域上空和一架VFA-103中队的F/A-18F对接加油时，发动机吸入加油锥套，这架闪电II的发动机遭到A级损伤，但安全返回航母，F/A-18F受到C级损伤，备降欧塞纳海军航空站，机组均没有受伤。
2018年9月28日，VMFAT-501中队的F-35B 168719/VM-01于东部时间11:45在波弗特以西4英里处的一座小岛上空坠毁，飞行员安全跳伞。地面上无人受伤，这是陆战队F-35B的首次坠机事故。有传言说这次坠机事故的主要原因是发动机问题，因此F-35联合项目办公室临时在10月10日让所有型号的F-35停飞，以便找出发动机的问题所在。但这次停飞的时间很短，只有几天，之后又重新恢复了飞行。
一架F-35A飞机短暂暴露了它的雷达信号，从而发射了一枚AIM-120 AMRAAM。
2019年4月9日，航空自卫队第302飞行队的F-35A 79-8705(AX-05/15-5158)于当地时间傍晚19:59从三泽升空，28分钟后失去联络，当时一共派出了4架飞机进行训练，此机为编队长机。晚上21:45，救援直升机在距离岸边80英里(130千米)的海上发现了飞机尾翼的部分残骸，飞行员细见彰里(Hosomi Akinori)三等空佐身亡。飞机残骸沉入1500米深的海里，给回收带来了极大的困难。航空自卫队给出的损失原因完全归咎于飞行员的操作失误，在大过载机动下没有做抗G动作，导致飞行员失去意识，也可能是全黑的夜空引发飞行员空间感扭曲。
2019年5月6日，岩国基地开放日刚结束后的第一天，一架VMFA-121中队的F-35B在起飞时撞鸟，飞行员不得不放弃起飞，虽然没有给地面的军事和民间设施造成损失，但飞机遭到A级损伤。
系统开发与演示阶段的测试包括GBU-39小直径炸弹(SDB)。
2020年5月19日美国东部时间21:26，58FS中队的F-35A 12-5053坠毁在埃格林基地的30号跑道上，飞行员身受轻伤，但安全弹射，这架价值1.76亿美元的飞机被大火烧毁。此机于20:15升空，前往W151A空域执行夜间战术拦截任务，是“蓝军”双机编队的长机，这样的任务一般包括了学员扮演的“蓝军”和教官扮演的“红军”。晚上21:16，此机以202节速度在埃格林基地的跑道触地，比标准的150节触地速度快了52节。5.2°的攻角也远小于降落时的8°最小要求。之后，飞机被弹回天上并剧烈仰起，过了5秒种，飞机失控砸向地面，飞行员提前跳伞。事故后的检查显示，飞机第一次弹跳后2秒，电脑的输入试图恢复飞行姿态，并回到降落高度，然而，飞机的仰角越来越大。飞行员强制向后拉杆后2秒，他把油门推到顶，试图获得速度。飞机坠毁时的平尾仍旧向下，证明飞行员向后拉杆的控制无效。最终证明事故原因首先是由于过高的进场速度和过小的仰角，其次，F-35的自动油门控制和交互检查问题也占了一部分，此外，头盔显示器符号的错位导致飞行员产生了误判，最后，飞行员的疲劳和缺少对飞行控制系统逻辑的认知酿成了这场坠机事故。
2017年2月21日，约翰.德克(John Dirk)少校驾驶的BF-01号机首次在空中用航炮吊舱开火。
2020年9月29日，在南加州上空的一次空中加油过程中，一架VMFA-121中队的F-35B(无线电呼号“Valt 93”)和VMGR-352中队的KC-130J 166765/QB相撞，F-35飞行员跳伞后身受轻伤，飞机坠毁在萨尔顿市附近S-22高速公路和好莱路之间。被撞的KC-130挂掉了2台发动机，但没有失去控制，并用机腹在因皮里尔县萨尔顿湖以北的波尔克大街和59大道之间迫降，机上8人安全生还。